Test et protocole culture in vitro

Ce forum est dédié à la culture in vitro des plantes carnivores (technique, milieux de cultures, etc.)

Test et protocole culture in vitro

Messagepar dede718 » 06 Jan 2013 1:25

Hello tout le monde ;)
Je vais développer ici mon test de culture in vitro petit à petit , il regroupera divers test et info trouvé sur le web ... :D

Utilisation de:

-Une blouse
-Des gants latex
-Une surface de travail propre, désinfectée et sans courant d'air( recouverte d'essuie tout imbibé de javel)
-Un scalpel et une pince
-Une zone stérile (crée à l'aide d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox)
-Un masque anti-poussières
-Des récipients (5 béchers, un récipient résistant à la chaleur pour faire chauffé le milieu...)
-De l'alcool à 70° (pour les avant-bras)
-De l'eau de javel
-Des récipients gradués et ou pipette-seringue
-De l'essuie tout
-Du film alimentaire

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ETAPE 1 : Préparation de la gélose

Je vais utilisé ici du milieu Murashige & Skoog ( qui est le milieu le plus utilisé)de concentration 10,0 (1000%)
Je souhaite préparer 100mL (environ 30mL par pot bébé) de milieu MS à 33%

Il me faut donc un volume de solution concentré X = (Volume de milieu final souhaité * La concentration en pourcentage du milieu final souhaité)/1000=(100*33)/1000= 3,3 mL

Il me faut une masse d'agar Xa = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration d'agar en g/L généralement entre 5 et 7)/1000=(100*7)/1000= 0,7g après un premier test avec une gélose trop molle à 5,6g/L j'ai du rajouté de l'agar donc prenez une concentration plus de 7-8 g/L et j'ai aussi remarqué qu'un refroidissement rapide de la gélose après stérilisation la rendait plus ferme.

Il me faut une masse de sucre Xs = ( Volume de milieu final souhaité * La concentration de sucre en g/L )/1000=(100*25)/1000= 2,5g

A tout cela ajouté la moitié du Volume de milieu final souhaité en eau déminéralisée stérile donc ici 50ml;
y ajouter les inhibiteurs comme la PPM "Plant Preservative Mixture" ( environ 1mL/L de Volume de milieu final souhaité )et autres hormones...

Ajuster toujours avec de l'eau déminéralisée stérile jusqu'au Volume de milieu final souhaité ici 100mL et ajuster le ph à l'aide d'une solution basique (une cuillère à soupe de bicarbonate de soude dissous dans une solution de 20 ml d'eau) ou acide (5 ml de vinaigre mélangé avec 25 ml d'eau) sachant que le pH optimum est compris entre 5 et 6.

Chauffer au bain marie la solution (ou un chauffe ballon), lorsque le liquide est semi-transparent, il est prêt à être versé dans les récipients préalablement lavé avec de la javel dilué à 20% à raison de 1cm de hauteur pour un semi à 2-3cm pour un repiquage.

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Stérilisation 20 à 30 min à partir du moment ou la cocotte minute siffle; ne pas dépasser cette durée pour ne pas détruire les éléments les plus fragiles présents dans la gélose comme les vitamines ou à l’autoclave (25 mn à 115°C ou 20 mn à 120°C).. Placer environ 2L d'eau au fond de la cocotte minute et placer les bocaux de gélose dans le panier, ils ne doivent pas être en contact avec l'eau ou la paroi.

Laisser refroidir sans enlever la soupape ( pendant environ 3h)

A ce moment là vous pouvez laisser votre gélose à la lumière pendant une dizaine de jours pour faire un test de contamination ou alors directement passé à l'étape suivant ;)

ETAPE 2 : Stérilisation des graines ou des fragments de tissus (L'installation)

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Avant toutes choses pour les graines on peut utiliser du papier filtre afin de pouvoir repêcher plus facilement les graines une fois trempé dans les différente solutions

Nous avons ici besoin de 5 béchers:

_ bécher 1 : Le mouillant, c'est une solution d'eau déminéralisé stérilisée et de liquide vaisselle qui a pour rôle de nettoyer les graines ou fragments afin de facilité une meilleur stérilisation par la suite. On peut aussi utiliser du mercryl laurylé qui est à la fois un désinfectant et mouillant ou alors de l'éthanol.

_ bécher 2 : Le stérilisant, c'est une solution contenant un produit chimique permettant de détruire les germes ( bactéries, champignons, virus)

*Différent stérilisant pouvant être utiliser:
_ Eau de javel 1/5 ou 1/10(5-8 min pour les graines de drosera, pour les fragments de tissus: jusqu'à ce que les bords du tissus coupé blanchissent puis recouper avant rinçage )
_ Hypochlorite de calcium 1 à 10% (ne nécessite pas de rinçage)( 7 min à 5% pour des graines de dionaea)
_ NaDCC 1,7g/L( ce que je vais utilisé, contient un peu moins de chlore actif que l'hypochlorite de calcium mais à l'avantage d'être plus stable)
_ Alcool à 70% ( pas d'effet fongique, il est donc utilisé en complément dans un bécher 2bis )
(3min pour des graines de dionaea)
_ Domestos (nettoyant wc ) dilué à 10% (résultat positif trempage 10min pour les tissus) ou 70% (résultat négatif, contamination)....


Tableau des valeurs pour NaDCC 1000ppm 1,7g/L

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_bécher 3,4,5: Le rinçage, il s'effectue dans 3 béchers remplient d'eau déminéralisée stérile, on peut aussi utiliser des solution d'inhibiteur faiblement concentré ( exemple PPM 0,5%) puis placer au micro onde à la limite de l’ébullition avant usage

J'ai aussi trouvé 2 autres méthodes utilisées pour les cactus (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_culture_in_vitro_premiers_pas) à noté l'utilisation d' HgCl2 très toxique et très difficile à trouver donc je vous le déconseille.

"Méthode 1

Matériel

Eau stérile
Papiers-Filtres non stériles
Agrafeuse
Un bécher (ou récipient servant de poubelle)
Une minuterie
Solution à 0.8 % de Javel, contenant 2 gouttes de mouillant (Triton, teepol, liquide vaisselle,…)
Solution à 3 % de Kohrsolin (Bode) liquide de désinfection du sol.
Alcool 70%

Méthode

Placer les graines dans un sachet fait à partir de papier-filtre plié et agrafé.
Mouiller le sachet dans un bain d'alcool 70 %.
Placer le sachet dans le mélange Javel 0.8 % + mouillant pendant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider la Javel, rincer une fois le sachet à l'eau stérile.
Placer le sachet dans le bain de Kohrsolin 3% durant 15 à 20 minutes et agiter de temps en temps.
Vider le récipient et rincer trois fois à l'eau stérile. Chaque rinçage durant plusieurs minutes.
Placer les graines sur milieu de culture.

Attention, ne rien écrire sur les sachets, tout s'efface !

Installation de boutures :

Le principe est le même, des bourgeons avec suffisamment de tissus sont placés dans l'alcool, puis dans la javel, puis dans le Kohrsolin et enfin rincés. Ensuite, ils sont retaillés et placés sur milieu de culture.

Méthode 2

Matériel

Eau stérile
Alcool 70%
Solution à 0.2% de HgCl2

Méthode

Laver les boutures à l'eau courante.
Les placer dans l'alcool à 70% durant 45 secondes.
Les placer dans la solution de HgCl2 pour 3 minutes.
Rincer cinq fois à l'eau stérile.
Rafraîchir les surfaces de coupe et placer les boutures sur leur milieu de culture, la coupe touchant le milieu."

Une fois la stérilisation faite pour les fragments il faut les recouper avec un scalpel pour éliminer les tissus qui n'ont pas survécu (en blanc)

Il ne vous reste plus qu'a les placer dans les contenants en étant bien sur dans un milieu stérile grâce à l'usage d'un bec bunsen, d'une hotte à flux laminaire ou d'une glovebox ;)

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Les "Hormones végétales" :

Ce sont des régulateurs de croissance et/ou de différenciation cellulaire, ils ont donc une action stimulante.
Il faut toutefois prendre des précaution car ce sont des molécules qui agissent à faible dose pour notre usage ( à forte dose elles ont été utilisé comme herbicide), aucune hormones n'a d'actions spécifiques et leurs actions est corroboré avec la présence d'autres hormones, celle-ci peut donc varier, les informations ci-dessous sont donc des généralités.

-Les auxines ou AIA (Acide Indole Acétique):(Substances similaire: acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, acide indole-3-acétique, acide indole-3-butyrique, acide 1-naphthalèneacétique,...) Sa synthèse a principalement lieu dans le méristème apical des pousses (groupe de cellules non différenciées, sans fonction autre que de se diviser et participer ainsi à la croissance de la plante) et en descendant dans la plante elle est à l'origine de la dominance apical en inhibant la croissance des bourgeons latéraux. Les auxines sont aussi à l'origine du phototropisme (capacité qu'a la partie aérienne d'une plante à se tourner vers la lumière)et du géocentrisme (capacité qu'a la partie souterraine d'une plante à se tourner vers le sol)
*allongement cellulaire
*callogenèse (cal=amas de cellules indifférenciées)
*rhizogénèse (formation de racines)
*différenciation cellulaire
*fructification ( à l'état naturel ce sont les graines qui produisent des auxines et fond murir le fruit, en pulvérisant des auxines sur un pied de tomate on peut obtenir des fruits sans graines car ils ne sont pas lié à une pollinisation)


-Les gibbérellines :
Ces hormones agissent de la même manières mais de façon plus ou moins importante, elles sont produites dans les jeunes feuilles et les racines
*augmentation de la distance inter-noeuds
*croissance des méristèmes
*stimulation sur le métabolisme et la production d'auxine
*favorisent la germination et permet de sortir de dormance des bourgeons
*stimulation de la fructification et de la floraison


-Les cytokinines :
(Substances similaire: zéatine, BAP, kinétine,...) Elles sont produites dans les tissus en croissance active (principalement dans les racines, embryons, fruits ). "En culture in vitro, leurs effets sont liés à ceux de l'auxine. On cultive un morceau de tige sans hormone, les cellules deviennent très grosses mais ne se divisent pas, si on ajoute une cytokinine, rien ne se passe, mais si on ajoute la même quantité d'auxine, les cellules se divisent, mais restent indifférenciées, on obtient un cal. S'il y a plus de cytokinines, le cal se différencie et des bourgeons apparaissent, s'il y a plus d'auxines, des racines se forment. Elles inhibent les auxines, provoquent la ramification, retardent la sénescence (on en pulvérise sur les fleurs coupées pour conserver leur fraîcheur)." (article publié par Mélanie Quennoz le 11/11/2001 http://www.cactuspro.com/articles/la_culture_in_vitro_premiers_pas))
*favorise la division cellulaire en présence d'auxine
*organogénèse (favorise la formation de bourgeons)
*inhibe la rhizogénèse
*stimulation sur le métabolisme
*permet d’empêcher la dominance apicale


-L'acide abscissique ou ABA ( de l'anglais abscissic acid):
Production dans les bourgeons et le rapport gibbérellines / acide abscissique fait partit des facteurs de germination des graines.
*inhibe la croissance
*freine la division cellulaire
*ferme les stomates en période de sécheresse
*déclenche la dormance


-L'éthylène : C'est la seule hormone végétale sous forme gazeuse.
*inhibe la croissance
*lié aux processus de vieillissement comme la chute des feuilles
*favorise la maturation des fruits (en dégradant la paroi des cellules et en bloquant la synthèse de la chlorophylle) et la floraison chez certaines plantes

Selon Skoog ( qui a donné son nom au milieu) le comportement d'un explant face à différente concentration entre auxine et cytokinine est le suivant:

*Si le rapport auxine/cytokinine est élevé on favorise la rhizogénèse.
*Si le rapport auxine/cytokinine est faible l'explant évoluera vers une fonction caulogène (formation de bourgeons).
*Si le rapport est voisin de l'unité on aura un comportement callogène.

Tableau pourcentage MS et phytohormone par espèces

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Et pour finir ma trombine en pleine action :tirelangue: elle est pas à mon avantage prolongation des fêtes de fin d'année oblige mais bon j'allais pas me rhabiller en clown pour votre plaisir ! :cassedanse:

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J’espère que ce petit récapepette vous aura plus !
Je vous ferais sans doute des photos pour illustré tout ça ;)

Pour les commentaires et les conseils n'hésitez pas ! sachant que c'est mon premier essaie ;)

Fred
Modifié en dernier par dede718 le 23 Jan 2013 19:26, modifié 3 fois.
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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar Vince81 » 06 Jan 2013 11:41

Super Fred, c'est cool de voir quelqu'un se lancer dans ce genre de manips. :)

Tiens nous au courant régulièrement, des bonnes avancées comme des mauvaises: je pense que ce topic fera un très bon post-it!
Vince
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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar dede718 » 06 Jan 2013 12:34

Merci Vince ;)
C'est assez passionnant même en dehors de cette manip sur ce qu'on peut faire, les découvertes, le rôle des hormones et tout ça !
Pas de soucis pour les avancées ;) après c'est un premier test pour prendre en main les différentes manip et souvent il faut plusieurs essaie pour parvenir à un bon résultat avec les bon dosages!
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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar Foyout » 07 Jan 2013 22:07

Alors là, chapeau pour ce post ! Je le met de suite en post-it. :D
C'est la première fois que tu tentes l'in vitro ? Tu as fait le tests sur quoi quelles graines/boutures ?
J'ai toujours entendu dire que la partie la plus délicate est la stérilisation du matériel végétal. Tu as utilisé quoi parmi ce que tu as décrit ?
"Il aurait un rire sardonique qui inspire la terreur, pas trop sardonique quand même, parce qu'il sait pas ce que ça veux dire...
quand c'est mal fait ça fait pas peur !"

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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar Jardimanche » 13 Jan 2013 22:25

Hello Fred!

Super protocole, précis et descriptif comme il faut! Bravo! Juste une petite question technique : comment stérilises tu ta glovebox? (Javel + A. Chlorhydrique?)

Aurais tu quelques photos de tes plantes/tissus/graines... in vitro?

Nicolas

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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar dede718 » 14 Jan 2013 0:10

Ah bah j'avais loupé des réponses =)
C'est la première fois que tu tentes l'in vitro ?

Oui c'est mon premier test :wink:
Tu as fait le tests sur quoi quelles graines/boutures ?


Alors j'ai testé des graines de Sarracenia, des explants de feuilles de Nepenthes ( pour celle là apparemment je m'y suis mal pris car je n'ai pas retrouvé de CIV à partir de feuilles mais plutôt à partir de tiges) et des explants de feuilles de dionaea ( j'ai sans doute pris des dionaea trop petite mais je voulais pas déranger les autres dehors)

Donc je pense que pour les deux dernier ça va pas le faire, mais ça fait maintenant 8j que j'ai manipuler et toujours aucune traces de moisissure donc c'est déjà un bon point !
J'ai cru lire que on pouvait savoir si on avait bien manipuler au bout de 10j pour les champignons et 1 moi pour les bactérie.
J'ai toujours entendu dire que la partie la plus délicate est la stérilisation du matériel végétal. Tu as utilisé quoi parmi ce que tu as décrit ?


J'ai utilisé le NaDCC c'est celui que j'ai eu dans mon kit et celui sur lequel j'avais le plus d'info :wink:


Super protocole, précis et descriptif comme il faut! Bravo! Juste une petite question technique : comment stérilises tu ta glovebox? (Javel + A. Chlorhydrique?)


J'ai utilisé uniquement de la javel à 20% que je vaporise de l'interieur

Aurais tu quelques photos de tes plantes/tissus/graines... in vitro?


Bah à part celle que j'ai dans le protocole avec les nepenthes je n'en ai pas d'autres car ça donne quasiment rien avec la condensation à l'intérieur des milieu mais si ça germe ou si il y a une infection .... bah je mettrais des photo quand même :wink:

Je me suis aussi acheté un bouquin ( "La culture in Vitro et ses application horticoles" J.B.BAILLIERE édition: Lavoisier) bon il est pas tout récent mais ya pas énormément de publication sur la CIV des plantes je trouve, on y trouve un peu de techniques mais surtout tous ce qui tourne autour de la CIV, les mutations, la mycorhization des milieux, les interactions avec les microorganismes, les limites et contraintes de la CIV... c'est un peu lourd à lire c'est vrai mais c'est super intéressant.
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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar kisscool-38 » 14 Jan 2013 10:26

dede718 a écrit:Donc je pense que pour les deux dernier ça va pas le faire, mais ça fait maintenant 8j que j'ai manipuler et toujours aucune traces de moisissure donc c'est déjà un bon point !
J'ai cru lire que on pouvait savoir si on avait bien manipuler au bout de 10j pour les champignons et 1 moi pour les bactérie.


Oulà malheureux! Compte au moins un mois avant de crier victoire. Même si ton milieu n'est pas contaminer au départ, il peut le devenir. Ce n'est que sur un temps long qu'on peut s'en rendre compte.

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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar dede718 » 14 Jan 2013 13:14

Bah c'est ce que j'ai écrit non :?:

au bout de 10j pour les champignons et 1 moi pour les bactérie.


De toute façon c'est sur il faut y aller étapes par étapes et rare sont ceux qui réussissent du premier coup.

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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar cedric » 12 Fév 2013 13:32

Hello,

Alors ça donne quoi?

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Re: Test et protocole culture in vitro

Messagepar dede718 » 12 Fév 2013 13:58

Alors pour le moment les résultats j'ai aucune contamination
-Pour les test avec les feuilles de népenthès les explants ont dépéri assez rapidement, il faut apparemment utilisé directement des tronçons de tiges
-Pour les Sarracenia, pas de germination
-Pour les Dionaea idem que pour les népenthès, j'ai sans doute confondu jeune plante et jeune feuille, enfin j'ai pas confondu mais j'ai pris des jeunes feuilles de jeunes plantes un peu trop fragile je pense
-Le seul résultat positif c'est pour les gemmes de D. scorpioïde qui eux se développent sans problème pour le moment ;)

J'ai par contre depuis fais tombé ma glovebox ( rebord de fenêtre + vent c'était pas une bonne idée ) et les boite de rangement étant pas très solide (encore plus si on fait des trous) celle-ci c'est cassé ... donc faut que je retrouve le temps de m'en refaire une :evil:
chuis assez étonné de son efficacité quand même car malgré une manipulation plus difficile, elle permet à première vu de bien gardé une atmosphère aseptisée

Fred
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