Hotte à flux laminaire.

Ce forum est dédié à la culture in vitro des plantes carnivores (technique, milieux de cultures, etc.)

Messagepar herve huet » 18 Mar 2007 22:08

Salut Zender,
Merci de nous tenir au courant. Donc felicitations, pour ton tube temoin. Par contre, avec tes graines, 3 contaminations sur 5, c'est pas terrible... Tu es sur que les contamination viennent bien de tes graines et pas de ton milieu (c-a-d de ta hote)? Si oui, a l'evidence, ton protocole de sterilisation est pas top, et tu devrais soit augmenter ton temps de trempage ou augmenter la concentration de ton produit decontaminant.
Pour la germination de tes graines de Dionee, si tu ne vois rien venir apres qq semaines/mois, tu peux les mettre au frigo qq semaines (les stratifier, quoi).
Effectivement, l'utilisation d'un prefiltre est hautement recommande.

A la reflexion, et en re-regardant le montage qui t'a servi de modele
En fait je me suis beaucoup inspiré sur cette hotte fait maison : Citation:
http://www.rossolis.org/article32.html

je pense que les hotes avec une vitre devant, comme la tienne, et de "rossolis" par exemple, sont des hotes a flux laminaire VERTICAL et non horizontal comme tu as construit! Donc, si tu veux essayer d'ameliorer, tu pourrais essayer de mettre la sortie de ton aspirateur par "le haut"...

Enfin:
j vais pouvoir commencer à utiliser les hormones pour faire des calls

:?: Pourquoi faire complique, quand on peut faire simple?
D'abord, comme tu sais surement, quand on utilise des hormones c'est pas pour obtenir des cals (qui sont parfois, une voie sans issu...), mais pour obtenir des bourgeons dans une premiere etape, puis des racines dans une deuxieme etape.
Mais surtout, pour bon nombre de PC (Dionee incluse), pas besoin d'hormone: ca prolifere bien tout seul, suffisamment en tout cas pour un non-professionel. Donc, laisse tes graines germer, tes vitroplantules pousser et quand le moment est venu (vitroplant assez grands) micropropage-les, sans hormone.

Bonne chance pour la suite.
Herve.

 
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Messagepar Zender » 19 Mar 2007 10:44

Salut,

oui j'ai un gros problème de stérilisation, en fait j'utilise de l'alcool à bruler que je dilut jusqu'à 70 %. Mais j'ai lu que l'alcool 70 ° ne tu pas les spores. Or quand tu mets des graines dans ton frigo (ce que j'ai fait d'ailleurs) les microorganismes sporules à cause des conditions non favorable et les spores sont beaucoup plus résistants. Peut-être qu'il faudrai laisser les graines 1 jours dans du coton mouillé avec un petit peu de sucre, les spores germeront et ce sera plus facile à stérilisé, une expérience à faire :wink: J'ai pu aussi lire que l'alcool iodé tue tous mais j'ai encore vu nulle part qu'on l'a dejà utilisé pour la CIV. Il reste l'eau de Javel mais il faut rincer 3 fois avec de l'eau stérile, c très chi... Bref sinon il y a l'hypochlorite de calcium mais pour lui il faut le préparer juste avant de l'utiliser et ça c aussi très chi...
Pour les contaminations que j'ai eu, il s'agit bien des graines, il n'y a pas de doute. Je ferai des photos ce week-end.
Voilà sinon pour l'ouverture par le haut, pourquoi pas mais bon j'ai déjà fait le trou donc ce serai dommage de tout redémonter. Je vais déjà voir ce que sa donne avec de grosse quantité de pots. J'ai en tout ensemmencé 12 pots et dans chaque pots 3 graines. J'ai fait l'expérience avec de l'alcool iodé et de lalcool 70°, mais malheuresement j'ai oublié de marquer sur les pots la façon de stériliser. :tapecontremur: Je suis trop dégouté, je referais l'expérience d'ici 1 à 2 semaines.

 
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Messagepar Amaury » 19 Mar 2007 14:02

Zender a écrit:Salut,

oui j'ai un gros problème de stérilisation, en fait j'utilise de l'alcool à bruler que je dilut jusqu'à 70 %. Mais j'ai lu que l'alcool 70 ° ne tu pas les spores. Or quand tu mets des graines dans ton frigo (ce que j'ai fait d'ailleurs) les microorganismes sporules à cause des conditions non favorable et les spores sont beaucoup plus résistants. Peut-être qu'il faudrai laisser les graines 1 jours dans du coton mouillé avec un petit peu de sucre, les spores germeront et ce sera plus facile à stérilisé, une expérience à faire :wink: J'ai pu aussi lire que l'alcool iodé tue tous mais j'ai encore vu nulle part qu'on l'a dejà utilisé pour la CIV. Il reste l'eau de Javel mais il faut rincer 3 fois avec de l'eau stérile, c très chi... Bref sinon il y a l'hypochlorite de calcium mais pour lui il faut le préparer juste avant de l'utiliser et ça c aussi très chi...
Pour les contaminations que j'ai eu, il s'agit bien des graines, il n'y a pas de doute. Je ferai des photos ce week-end


Salut Zender,

J'ai fait quelques expériences de CIV il y a deux ans sur des dionées.

Pour ce qui est des graines, ca a été du gateau, après 3 essais, je réussissais tous mes semis. :cool:
Parcontre, je n'ai jamais réussi une seule bouture et j'ai arrêté mes expériences (j'y reviendrai bien un jour!). ::e21

Les graines sont vierges (normalement) de tous micro-organismes donc il n'y a que l'exocarpe (l'enveloppe de la graine) à stériliser.
Parcontre, les tissus (même ceux d'une plante saine) sont toujours habités par toutes sortes de micro-organismes qui se développeront à une vitesse maximale lorsqu'ils se trouveront dans le milieu. :?

Le plus dure est d'éliminer tous ces intrus sans tuer les cellules!

Pour ce qui est des graines, je n'ai pas investi un sous dans du matériel, il suffit de trouver un large plan de travail en pierre/carrelage/... dans une pièce sans courant d'air. Il te faut 3 bougies ou un bunzen et une pince.
D'abord tu te laves les mains et les bras avec du savon, tu laves ta table avec de la javel. Ensuite, tu prépares un verre contenant de la javel diluée dans de l'eau. Tu laisses tremper les graines dans celle ci 2 minutes et ensuite tu prends uniquement les graines qui ont coulé que tu placeras dans tes pots de CIV en veillant à rester le plus près de la flamme... et c'est gagné :D

Je te conseille d'aller faire un tour sur le site de clivia et celui du cédevit.

Bonne chance pour tes futures expériences!

Amaury

 
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Messagepar Zender » 21 Mar 2007 12:41

Merci pour tes conseils.
C bizarre, tu ne lave pas tes graines à l'eau stérile avant de les mettre dans le milieux?

 
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Messagepar herve huet » 21 Mar 2007 22:35

Salut Zender,
Ben oui, tu le sais donc maintenant, l'alcool ne sterilise pas suffisamment! J'ai jamais entendu parler de l'alcool iode. Pourquoi pas (et j'attend donc les resultats de ta derniere manip), mais qd mm la routine c'est de steriliser avec un produit a base d'eau de Javel ou assimile (voire une serie: detergent/savon-->alcool 70%--> Javel-->eau).
Tu dis que c'est ch… de preparer ou rincer! Qu'est-ce qui est plus ch…: de prendre toutes les precautions pour bien steriliser tes graines ou de balancer plus de la moitie de ton boulot? Evidemment, quand tu as entre les mains qq graines rares, la question est toute repondue. De toute facon, il faut bien l'avouer, la culture in vitro c'est ch…! Celui qui dit que c'est hyper fun, en fait de la publicite mensongere: quand tu auras des centaines d'explants a propager et transferer chaque 2-3 semaines (c'est tout le mal que je te souhaite), tu verras que la CIV c'est pas toujours marrant.
L'idee de faire pretremper tes graines n'est pas bonne a mon gout, car tout l'interet des graines c'est qu'elles sont "endomis" et sont des tissus relativement coriaces, et donc on peut en general mettre la dose en desinfectant (a l'inverse de tissus plus "mous", et comme par exemple une graine imbibee).

Ceci dit, voila ce que j'avais ecrit en Mars 2004 pour la Newsletter de Jeff. C'est toujours ce que j'utilise en 2007 (on ne change pas une equipe qui gagne).

Sterilisation des graines pour la culture in vitro

La premiere etape de culture in vitro est la sterilisation du materiel (graines ou autres). Cette etape est cruciale et delicate, car soit on ne fait pas assez (on n'a pas tue tous les "germes", qui vont vite proliferer et envahir le milieu de culture in vitro), soit on fait trop fort (on a tout tue, graines comprises...). Il existe de nombreuses "recettes", plus ou moins basees sur l'utilisation d'eau de Javel ou d'autres produits hypochlores. En voici donc une de plus: celle que j'utilise depuis 4-5 ans.

Le desinfectant que j'utilise est un produit commercial du nom de "Taharsept", desinfectant a des fins multiples (veterinaires, agricoles, alimentaires, sanitaires, etc.), servant par exemple a desinfecter, en fonction de la dose, des plantes, de l'eau, les mains, etc.... D'apres ce que j'ai compris, il a ete mis au point par une companie irlandaise (Medentech), qui le vend, je crois, sous le nom d' Aquasept, et on peut donc en savoir plus sur leur site web [http://www.medentech.com/index.cfm]. A vrai dire, comme je ne reside pas en France (ou autre pays francophone), je ne sais pas si cela y est trouvable, mais si non, il doit etre possible de commander (par le web). Ce que je sais, c'est que Taharsept se vend (ou se commande) dans des grandes pharmacies en Israel...
Bon, ceci dit, l'interet de ce produit, c'est que ca se presente sous la forme de tablettes, ou pillules "seches", et donc c'est facile et non dangereux a manipuler et a conserver; mais surtout, le grand avantage, c'est que ca marche! En effet, sans entrer dans les details, le principe active (le troclosene de sodium - http://www.animalhealth.bayer.com/ah/po ... enDocument) n'est pas le meme que d'autres hypochlorites, et permet une efficacite accrue avec une toxicite moindre. Et de fait, avec le protocole qui suit, je n'ai pas observe de toxicite sur mes graines (meme celles de Nepenthes, qui sont dites fragiles).
Entrons dans le detail:
J'utilise un melange a 5.2g/3litres (5.2 g, une tablette entiere, dans 3 litre d'eau sterilisee), auquel j'ajoute quelques gouttes de "Tween" (par exemple 10microlitre pour 40mililitres) (c'est une sorte de detergent de labo, qui joue le role de mouillant; il peut donc surement etre remplace par du savon ou du produit a vaisselle). Je garde cette solution dans une petite bouteille fermee, a la temperature ambiante, pour des mois.
A 99%, ce sont des graines que je sterilise.
En "routine":
- je trempe mes graines 3 a 5 minutes dans cette solution, en agitant de temps en temps
- je rince avec de l'eau sterile (c'est a dire, passee prealablement a l'autoclave, ou cocotte-minute) de 3 a 5 fois.
- c'est tout: je mets sur mon milieu de culture. Eventuellement on peut faire une priere, mais ca marche tres bien sans....

En fait, ce n'est pas tout, car j'ai un autre "truc": je mets un produit dans mes milieux de culture qui s'appelle "ppm", qui est un produit americain pour la culture in vitro. La encore, je vous invite a aller voir le site [http://www.ppm4plant-tc.com/], et la encore, je ne sais pas si c'est disponible en France (je crois en fait, qu'ils cherchent un distributeur; a bon entendeur....), mais apparemment ca peut se commander en ligne. Le principe actif entre dans les cellules des bacteries et moisissures, qu'il tue, mais ne peut penetrer dans les cellules vegetales. Le producteur montre se produit un peu comme miraculeux; je ne serais pas aussi enthousiaste (dans certains cas, j'ai toujours des contaminations dont je ne peux me debarrasser), mais ce qui est sur, c'est que ca ne fait pas de mal...
En routine, j'en mets dans mes milieux apres autoclave (mais ca peut etre mis avant), a raison de 0,1% (volume a volume).

En conclusion, cette petite recette marche bien dans l'ensemble. Il y a bien quelques cas ou je n'arrive pas bien a decontaminer mes graines (ou en tout cas, pas du premier coup), et il y a surtout des cas ou mes graines sont bien sterilisees, mais ne germent pas! Mais je ne sais si c'est parce que j'ai eut la main trop lourde, ou si mes graines n'etaient plus viables, ou si elles ne sont pas encore reveillees...

Ce truc du Taharsep m'a ete donne par un chercheur, specialiste de CIV. Le probleme est donc de trouver ce Taharsept, ou son equivalent francais; mais je suis sur que c'est possible.
Concernant le "ppm" un collegue a moi, m'a recemment dit que ca serait plutot un gros coup de bluff!... en tout cas, ca fait pas de mal.

Voili!
Herve.

 
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Messagepar Zender » 24 Mar 2007 17:02

Bonjour à tous,

Merci pour ta réponse. Il a l'air terrible ce Taharsept, je vais tenter de faire des recherches sur ce produit.

Concernant ma hotte, j'ai aujourd'hui rajouté un pré-filtre, c vrai que mon filtre hepa commençait déjà à être coloré. Sinon pour les résultats de mes manip, et bien sur 12 pots, 3 ont été contaminés par une graine de dionée sur les 3 graines mis dans chaque pot. 1 pot seulement a été contaminé par l'extérieur et il s'agissait d'une bactérie. J'ai donc pas eu de mal à l'enlever avec un bout de gélose. Voilà jespère que ça se maintiendra à ce taux de contamination.


Je n'ai pas assez rajouté d'agar dans le milieu et en déplaçant le pot, la bouture est tombé : :bravo: . Du coup sur l'extrémité inférieure il y a eu la formation d'un call :razz: alors que le milieu est sans hormone. Etrange non :?: . Je pense que c'est le fait que l'auxine (une des hormones necessaire pour faire un call) ne se déplace dans la plante que dans un sens ( du haut vers le bas) du coup le call ne s'est formé que sur une extrémité.

 
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Messagepar Zender » 03 Avr 2007 13:43

Toujours pas de nouvelles contaminations après trois semaines :cool: . J'espère que ça continuera sur cette voie

 
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Messagepar Amaury » 03 Avr 2007 16:41

Félicitations :cassedanse:

 
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Messagepar Districarnivores » 22 Avr 2007 7:48

Salut à tous

De toute facon, il faut bien l'avouer, la culture in vitro c'est ch…! Celui qui dit que c'est hyper fun, en fait de la publicite mensongere


Si tu peux travailler dans des conditions stériles c'est pas chiant mais cela représente beaucoup d'heures de boulot!

Pour la stérilisation des graines de Dionaea :

env. 10mns dans 5-10% de javel. (agiter continuellement)
rinçage à l'eau stérile 3x

Possibilité de stocker les flacons pendant 3 semaines à 5°c puis normalement à 25°c, les germinations se produisent au bout de 3 sems env.

A+
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