Sur la route de la culture in-vitro

[thor]

Après mûre réflexion et beaucoup d’hésitation, j'ai décidé de sauter le pas et de me lancer dans la culture in vitro.

Première étape:la recherche du matériel et des produits

Quels produits acheter?

Vous avez plusieurs possibilités dans le choix des fournisseurs et la présentations des produits

1. Vous achetez tous les produits de base
Cela est simple mais cela présente des désavantages.D'abord le prix car pour être rentable il vous faut préparer beaucoup de gélose,ensuite l’équipement en effet une balance de précision est nécessaire mais bien sûr le stockage est plus facile et vous pouvez faire varier à l'infini les concentrations de chaque produit.

2.Certains fournisseurs scolaires proposent des milieux prêts à l'emploi sans les hormones, l'agar.
Facile pour débuter mais il est impossible de varier les concentrations de plus ils souvent plus chers

3.Acheter les macro-éléments, les micro-éléments, les hormones, le saccharose, l'agar séparément.
J'ai choisi cette solution intermédiaire qui me permet une certaine latitude dans mes choix

J'ai d'abord cassé les pieds à mes collègues pour récupérer des grands pots pour bébé.Après avoir obtenu un nombre suffisant de pots ,je suis parti à la recherche de Magenta B caps

Maintenant j'ai recherché les ingrédients de la gélose, j'ai privilégié les poudres pour une question de stockage et conservation.
Vitamines

Les phytohormones (10mg par flacon)

les ingrédients pour la fabrication du fer chélate à savoir le sulfate de fer et de l'acide éthylène diamine tétraacétique


Conservation des phytohormones

Comme on peut l'observer,chaque flacon contient 10ug d'hormones alors après dissolution dans 10 ml de solution et après prélèvement de la quantité nécessaire direction le congélateur.Pour éviter les décongélations et les congélations successives qui risquent d'abîmer les hormones on peut aliquoter la solution dans des micro-tubes ou des tubes à hémolyses.

[arnaudcarni]

ha c'est vraiment cool ça !! c'est vraiment un truc que je trouve génial !! bonne chance pour la suite !!

[A_polo_13]

Salut,
Bonne culture.
Quelle est la spécificité des capsules Magenta B? Et son utilité?

Lorsque je faisais de l'Iv (il y a 8 ans), j'achetai des milieux tout prêt en poudre, pour débuter je trouvais ca plus pratique que de chercher éléments par éléments à moins de se lancer à grande échelle.
Mon objectif était partir de graines et faire pousser, pas de faire de la modification génétique.

Un peu d'eau, la poudre, 1mn au micro-onde et hop, la soupe est prête. Plus qu'a verser dans les pots et stériliser.

J'utilisais du coton cardé pour les échanges gazeux, ca permettait aussi à la pression dans le bocal de sortir sans faire sauter les bouchons à la sortie de la cocotte minute. Quand tu as 60 à 100 pots a stériliser (flacon pour un litre de mélange), faut que ca débite avec la cocotte sinon les bactéries se développent dans les pots en attente.





Lien vers le forum "ou acheter le matériel"
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A+

[thor]

Quelle est la spécificité des capsules Magenta B? Et son utilité?

Par facilité, je vais utiliser des capsules en remplacement du coton cardé qui doit normalement être recouvert de papier aluminium lors de la stérilisation, de plus ils sont réutilisables

, j'achetai des milieux tout prêt en poudre, pour débuter je trouvais ca plus pratique que de chercher éléments par éléments à moins de se lancer à grande échelle

J'ai préféré acheter les éléments (vitamines, macoéléments, mcroéléments..... )séparément pour pouvoir varier les concentrations dans la soupe sans compter que je possède déjà certains produits.

[A_polo_13]

Pour les capsules, elles ont quoi de spécial?

Pour le coton carde, le papier aluminium sert à quoi?

[thor]

Même principe que les bouchons sur les tubes à vis, ils laissent passer un peu d'air tout en fermant le pot.Le papier d'aluminium empêche le coton d’être tremper lors de l'auto-clavage.

[thor]

Deuxième étape:la gélose et la stérilisation

Pour un premier essai j'ai décide de fabriquer 2 x 500ml à partir des macro-éléments, des micro-éléments, du fer chélate, de 30g/l de saccarhose, de 10g/l d'agar mais avec des concentrations différentes d'hormones.

Ajustement du pH

Le milieu MS nécessite un pH voisin de 5,7, donc pour l'ajuster on utilise de l'acide chlorhydrique ou de la soude concentrés (1 mole/litre ), quelques gouttes suffissent ; dans mon cas après vérification au pH-mètre il était de 4,3 et de 3,7, donc une correction s'imposait.


Fabrication de la gélose

Après avoir ajouter les 10g/litre d'agar,le milieu apparaît trouble.

Il faut faire fondre l'agar pour qu'il puisse se mélanger correctement avec le milieu contenant les divers éléments.Pour cela deux moyens simples: la plaque chauffante ou le micro-onde mais attention il faut penser à bien mélanger le tout régulièrement pendant l'opération car l'agar a tendance à se déposer au fond du récipient et à brûler.
L'opération terminée, le liquide doit être plus brillant et plus translucide ,signe que l'agar à bien fondu.Car sinon lorsque vous allez remplir vos pots ,ceux-ci auront des consistances différentes avec plus ou moins d'eau.
Maintenant il suffit de remplir les pots.


La stérilisation

Autant on peut être imprécis au niveau des quantités nécessaires à la fabrication du milieu, on travaille ici en gramme et centièmes de gramme voir même en microgramme, autant la stérilisation doit être réaliser avec le plus grand soin car cela a une influence sur le reste du processus de culture in-vitro.
Là aussi il existe deux moyens de stériliser correctement les pots soit la casserole à pression ou pour les plus chanceux l'autoclave

Stérilisation à 121°C pendant 15 minutes.
La stérilisation terminée, il faut un peu de patience .En effet il vaut mieux laisser la casserole se refroidir que d'utiliser la soupape , la décompression risque de faire sauter les capuchons ou de vider partiellement les pots.
La gélose refroidie, elle est maintenant figée.Autre précaution à prendre comme la gélose est semi liquide (10g/l contre 15-18 g/l pour les géloses solides), ne pas l'agiter car sinon vous risquer de rompre la trame qui retient l'eau.Les pots non utilisés peuvent être stockés dans un lieu frais mais pas au congélateur en attendant une utilisation future.

Prochaine étape: Le grand jour

[Franck31620]

Bonjour,
Je trouve ta quantité d'agar un peu élevée, pour ma part, je la dose à 5.5g/l.
Cela va avoir une influence sur la disponibilité des sels minéraux à l'intérieur de ta préparation.
Bon courage pour la suite...

[thor]

Salut

L'agar est un simple gélifiant, il n'intervient pas dans la disponibilité des sels minéraux.Si le milieu a été bien homogénéisé, la répartition est uniforme.Pourquoi le choix de 10g d 'agar?
Entre 10-18g/L le milieu est solide, , entre 5 et10g/L le milieu est semi-solide( ou semi-liquide) et du liquide peut apparaître en surface (pas terrible), sous 5g/L le milieu est mou.Donc mon choix c'est porté sur 10g/L.

[Districarnivores]

Salut,

L'agar est un simple gélifiant, il n'intervient pas dans la disponibilité des sels minéraux.

Franck a raison, l'agar agar a une influence importante sur la pression osmotique et donc sur la disponibilité des éléments. La fermeté d'un agar donné varie en fonction de certaines variables comme le pH, la quantité de certains ions...

Entre 10-18g/L le milieu est solide, , entre 5 et10g/L le milieu est semi-solide( ou semi-liquide) et du liquide peut apparaître en surface (pas terrible), sous 5g/L le milieu est mou.Donc mon choix c'est porté sur 10g/L.

En culture in vitro de plantes, le dosage de l'agar agar est d'environ 5 à 8 g/l suivant les espèces et l'objectif de culture (dans mon cas 5 g/l pour les Nepenthes ). Des doses plus élevées sont utilisées en microbiologie (culture de bactéries, de champignons...)
Mais si cela fonctionne bien pour toi avec ce dosage, il n'y a pas raison d'en changer

Cordialement,
Fabrice